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艾滋病检测关键词】获得性免疫缺陷综合征HIV实验室技术和方法艾滋病(AIDS)又称获得性免疫缺陷综合征,是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的一种免疫缺陷性疾病［1］.HIV感染的诊断是艾滋病预防控制工作的重要组成部分,建立敏感实用的检测方法对于监测,诊断或血液筛查,控制艾滋病的流行显得尤为重要.以下本文就HIV的检测技术现状及进展做一综述.1HIV的感染机制及感染标志HIV病毒侵入人体后,其表面糖蛋白gp120与细胞表面受体蛋白CD4以高亲和力结合,吸附到宿主细胞上;gp120再与宿主细胞表面辅助受体相互作用,使病毒与宿主细胞膜更接近;gp41产生一系列构象变化,其N端的融合肽片段插入宿主细胞膜,导致病毒包膜与细胞膜的最终融合,病毒RNA进入细胞.在HIV感染后,最先能够监测到病毒RNA,然后是p24抗原,最后是抗体［2］.在感染后的10～14d内,病毒RNA水平是呈指数上升,随后下降并保持在持续稳定的水平上,进入HIV无症状期［3］.p24抗原水平随着病毒RNA水平的发展而发展,在急性感染期就可以出现,被认为是病毒复制的间接标志,但由于检测方法的灵敏度不够而使得其检出时间要比RNA晚.从HIV感染到能够检测出HIV抗体这一时期,被称作“窗口期.在窗口期,能够通过病毒RNA,p24抗原和CD4淋巴细胞水平来确定HIV感染.CD4淋巴细胞水平随着感染的发展而逐渐下降,当其在血液中细胞下降到200个/mL时,就会发生[1]严重的免疫缺陷,患者就被确诊为艾滋病.病毒RNA,p24抗原,HIV抗体和CD4淋巴细胞水平可以用来确定HIV感染,检测病情发展［4］.HIV在病毒分类中属逆转录病毒科慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒组.迄今为止,根据血清学反应和病毒核酸序列测定,全球流行的HIV可分为2型：HIV�1型和HIV�2型［5］.在HIV�1型内,根据编码包膜蛋白的env基因和编码壳蛋白的gag基因序列的同源性又进一步分为3个组：Ｍ组（主要组）,Ｏ组（外围组）和Ｎ组（新组或非M非O组）,Ｍ组内又可分为Ａ�Ｊ10个亚型.在HIV�1型和HIV�2型之间,其核苷酸序列有45％的同源性,并且存在免疫交叉反应.应用免疫印迹法(Westblot)可以将二者明确地区别开来［6］.2HIV感染的主要检测方法目前检测HIV的方法有100多种［7］,总体来说可以分为抗体检测和病毒检测两大类.病毒检测包括细胞培养(病毒分离),p24抗原检测和病毒核酸检测.早期对HIV的诊断主要是通过血清学试验检测抗HIV的抗体,间接地诊断HIV感染.近几年,分子生物学方法不断被应用到HIV的检测中,HIV的实验室诊断方法取得了很大的进展,核酸检测已经成为了HIV实验室诊断的发展方向［8］.抗体通常是在感染后3～8周能够被检测出来［9］.目前,大多应用双抗原夹心法,这种方法具有很好的灵敏性和特异性.抗体检测由初筛和确认试验组成,初筛试验呈阳性的必须进行确认试验.酶联免疫吸附分析(ELISA)方法有一定的灵敏度,且操作简单,快速,适合对大量样品的检测.因此,是目前临床通用的初筛检测方法.国际上有3种确认试验方法［10］,包括免疫印迹试验,条带免疫试验及免疫荧光试验,目前以免疫印迹试验最为常用.在窗口期,病毒抗体不能被检出,但可以检测到病毒相关抗原或分离病毒.抗原能够在个体感染后先于血清转化2～18d被检测到.因此,在血清转化期通过检测p24抗原有着很大的优势,可以作为早期辅助诊断HIV感染的一种方法［11］.病毒培养是检测HIV感染最精确的方法.一般采取培养外周血单个核细胞(PBMC)的方法进行HIV的诊断［12］.病毒核酸检测通常是通过检测HIVRNA水平来反映病毒载量,具有很高的灵敏度,使用适时荧光聚合酶链反应(PCR)技术,能够在HIV感染的前2周检测到病毒核酸.病毒核酸检测方法可用于HIV的早期诊断,如窗口期辅助诊断,病程监控,指导治疗方案及疗效测定,预测疾病进程等.目前常用的测定方法有逆转录PCR实验(RT�PCR),核酸序列扩增实验(NASBA),分支DNA杂交实验(bDNA)等.使用高灵敏度的适时荧光PCR技术,能够在HIV感染的前2周检测到病毒核酸［13,14］.2.1HIV抗体,抗原检测HIV抗体一般在人感染后几周逐渐出现,可延续至终生［15］,血清学试验分为初筛和确认试验.最常用的初筛试验和确认试验分别是酶联免疫吸附试验和免疫印迹试验(WB.常规实验方法：酶联免疫吸附试验,免疫印迹试验(WestBlot),间接免疫荧光法(IFA.快速检测方法：明胶颗粒凝集试验,斑点免疫结合试验,Ｐ24抗原的检测,分子生物学方法,RT�PCR检测法,荧光实时PCR检测技术,支链DNA（bDNA）,连接酶酶促链式反应(LCR),核酸序列依赖性扩增(NASBA),转录介导的扩增(TMA)2.1.1酶联免疫吸附试验ELISA法的基本原理是免疫反应物通过化学或免疫学的方法形成酶结合物,酶结合物能与待检样品中相应的抗原或抗体结合成为免疫复合物,然后加入酶底物,经酶的催化或水解作用,无色底物产生颜色,用肉眼,分光光度计观察结果.初筛用的HIVELISA试剂目前已经发展到第四代检测试剂.第一代试剂主要以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板,以检测血清中的抗体.由于包被的抗原不很纯,假阳性率较高.第二代试剂使用基因工程方法得到的重组抗原和合成肽包被反应板,由于纯化抗原的使用,特异性有了很大提高.第三代试剂使用双抗原夹心法检测抗体,进一步提高了敏感性.第四代试剂则在第三代的基础上进一步增加了P24抗原的检测,把HIV抗原和抗P24的抗体同时包被反应板,可同时检测血清中的HIV抗体和P24抗原.2.1.2免疫印迹试验免疫印迹试验主要用于确认试验,基本原理是HIV全病毒抗原经过SDS�PAGE电泳,将分子量大小不等的蛋白带分离开来,然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上.将此膜切割成条状,每一条硝酸纤维素膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原.将待检血清样品用稀释液稀释成1/100,再把它直接加到硝酸纤维素膜上,恒温震荡,使其充分接触反应,血清中若含有抗HIV抗体,就会与膜条上的抗原带相结合.加入抗人IgG酶结合物和底物后,即可使有反应的抗原�抗体结合带呈现紫褐色,根据出现条带情况判定结果.有报告说,免疫印迹试验的特异性不是很好,有大约2％的假阳性率,但免疫印迹试验依然是目前最常用的HIV确认试验.2.1.3免疫荧光试验(IFA)基本原理为应用Ｈ�9或HUT�78培养细胞作为载体,用HIV感染细胞,该细胞内就会含有HIV抗原,将HIV感染的淋巴细胞涂于玻片上,固定,制备为抗原片,加入待检血清,待检血清中的抗HIV抗体与抗原结合后,再与荧光素标记的抗人Ig结合,在荧光显微镜下可见到细胞内有黄绿色荧光。
