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乳酸菌细菌素的分子生物学研究进展　中国微生态学杂志2000年第12卷第2期朱文淼　刘稳　关键词：乳酸菌细菌素分子生物学　乳酸菌是一大类发酵糖产生大量乳酸的兼性厌氧菌，广泛应用于医药、食品、发酵等工业，主要包括乳杆菌(Lactobacillus、乳球菌(Lactococcus、明串珠菌(Leuconostoc、片球菌(Pediococcus、链球菌(Streptococcus、肠球菌(Enterococcus、双歧杆菌(Bifidobacterium)和肉食杆菌(Carnobacterium)等属［1］。许多乳酸菌除产生乳酸、乙酸和双乙酰外，还可产生一些具有抑菌或杀菌作用的细菌素(bacteriocin，在食品防腐保鲜中起重要作用［2］。细菌素的含义可以这样理解。细菌素是由某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽，抑菌范围不仅仅局限于同源的细菌，产生菌对其细菌素有自身免疫性［3］　1　乳酸菌细菌素的分类　基于分子量、热敏感性和是否含修饰性氨基酸，可将乳酸菌细菌素大致分为三类(1)小分子热稳定肽(small heat-stable peptide, SHSP);(2)大分子热不稳定蛋白(large heat-labile protein, LHLP(3)羊毛硫抗生素(lantibiotics。新近又在乳球菌LMG2081中发现了新的细菌素—lactococcin G 。该细菌素由两个独立存在、高度疏水的热稳定小肽分子组成，其最大抑菌作用依赖于这两个小肽分子的协同作用，这明显不同于其它细菌素，因此单独列为第四类细菌素，即依赖于两个或两个以上小肽分子协同作用的细菌素　目前研究最彻底、应用最广的细菌素当属由各种乳酸乳球菌产生的乳链菌肽(nisin)［4］。另外，对于乳脂乳球菌的lactococcin，嗜酸乳杆菌的lactacin F，冰冷明串珠菌的leucocin A 和乳酸片球菌的pediocinPA—1的分子生物学研究亦取得了重大进展［5］。与nisin不同，它们均由质粒编码控制；由乳杆菌产生的细菌素lactacin B、lactocin 27和helveticin J则与nisin相似，其结构基因位于染色体上，由染色体基因编码、控制　2　小分子热稳定肽(SHSP　对乳酸菌细菌素的分子遗传学研究表明许多细菌素的产生与质粒相关。图1是六种质粒编码细菌素的遗传图谱，不难发现，对于每一种细菌素，其结构基因总是与两个或多个相关基因紧密排列构成一个类操纵子结构模块　2.1　遗传学分析　乳球菌中研究较深入的SHSP当属乳脂乳球菌9B4产生的lactococcin A、B和M，其结构(lcn)与免疫(lci)基因均定位于一个60kb大小的接合质粒(P9B4-6)上，且免疫基因都是位于相应结构基因下游，并构成一个操纵子(图1。其中lactococcin M的操纵子子中还存在一个功能未知的基因lcn Mb，其表达为抗菌活性所必需。已知三种细菌素的抑菌活力存在很大差异，但此差异似与启动子无关；研究发现其结构基因上游核苷酸序列呈现高度同源性，引物扩增分析证实其有效启动子序列即位于此同源序列中。目前，lactococcin A、B和M操纵子的克隆基因已在乳酸乳球菌IL1403中表达成功。此外，对乳酸乳球菌双乙酰亚种WM4的lactococcin A操纵子的研究结果［6］证实该细菌素的结构与免疫基因位于一个136kb的质粒(pNP2)上，序列分析表明这两个基因与9B4的lactococcin A的结构与免疫基因相同。值得一提的是，WM4的lactococcin A操纵子结构中除lcn A和lci A基因外，其上游还含有lcn C和lcn D基因，在lactococcin A的表达及分泌中起重要作用。操纵子结构的最前端则是一个启动子结构，负责起始lcn C、lcn D、 lcn A和lci A的多顺反子转录　乳杆菌中研究较深入的SHSP当属嗜酸乳杆菌11088的lactacin F，其产生与一个大接合质粒相关。目前，利用穿梭载体将该接合质粒上一段包含lactacin F结构和免疫基因在内的2.2kb的DNA片段克隆、导入不产lactacin的同源乳杆菌中，表达成功。核酸序列分析表明此DNA片段中存在一个含4个开放读码框(ORF)的操纵子结构，第一个ORF(laf)是lactacin F的结构基因，紧随其后的是两个重叠基因(图1。laf后面的三个ORFs可能参与lactacin F的表达及分泌，其具体功能有待研究　明串珠菌的SHSP研究主要集中在冰冷明串珠菌的leucocin A- UAL187，对其N-末端氨基酸测序并据此应用反向遗传技术由一个11.6kb的质粒中克隆到一段DNA，其中存在一个由leucocin结构基因和两个ORFs组成的操纵子结构(图1，基于其它同类细菌素的相似结构，推测其中的ORF2可能负责leucocin的免疫性。pediocin PA-1的基因克隆及核苷酸测序则显示其编码质粒上存在一个四基因的操纵子(图1，将此操纵子在重组质粒中克隆并导入E.coli表达，则产生并分泌出了有生物活性的pediocin。操纵子结构中的ped D远远大于其它细菌素基因，对于pediocin的产生至关重要，它编码一个724氨基酸的蛋白，参与pediocin的运输和传递过程。图1　2.2　结构上的共性　不同SHSP的氨基酸序列比较显示出一些共性(1)N-末端信号肽长度均为18～21氨基酸(2)前体肽的起始氨基酸为Met，紧随其后的氨基酸残基通常为Lys残基(3)N-末端信号肽的-1和-2位置上为两个Gly残基(4)成熟的细菌素其N-末端+1位置上通常是Lys或Arg残基。Lactococcin A、B、M的N-末端信号肽呈现高度同源，提示其操纵子结构可能受同一类启动子调控，而信号肽酶切位点G—G后的氨基酸序列则无明显类似性［7］，基于启动子和N-末端信号肽的高度同源性，可以确定此三种细菌素生物学功能上的变异并非源于转录水平的变化。研究表明，大量分泌蛋白前体的信号肽序列都有一个保守的三联结构：一个带正电荷的N-端区域，一个中央疏水区域和一个极性的C-端区域，三个区的长度分别为1～5、7～15和3～6个残基，其中C-末端为信号肽酶的识别位点，其模式为XXA(G)↓(X为任意一种氨基酸，↓为酶切位点。lactacin F前体肽的N-端先导肽较其它细菌素短，但仍符合上述信号肽特征。二级结构预测显示lactacin F分子N-端有一段α-螺旋，信号肽酶切位点处则有一个β-转角。值得一提的是，lactococcin A、B和M的前体肽-3位置上均为Asn残基，这在其它分泌蛋白前体的信号肽中极为罕见。Holo等人［8］认为lactococcin A的成熟过程是两步行为：信号肽酶首先水解Gly-Gly之间的肽键，移去前体细菌素N-端20个氨基酸大小的信号肽，然后再水解去除剩余肽段的N-端Gly残基，最后形成一个54氨基酸大小的成熟细菌素　2.3　运转机制　分析SHSP的N-端先导序列发现并没有典型的信号肽结构，除lactacin F外，其它SHSP的N-端先导序列中缺乏分泌蛋白信号肽所共有的中央疏水区，其前导序列较短，且含有数个酸性氨基酸残基。由此提示SHSP中可能存在一种新型的转运机制。另外，由前面讨论可知，WM4的lactococcin A结构基因上游的lcn C、lcn D基因可能参与细菌素表达及分泌。研究发现IL1403染色体上部分序列与WM4的lactococcin A基因簇序列高度同源，提示IL1403染色体上可能含有类似于lcn C、lcn D的基因。由此，将携有lactococcin A结构和免疫基因的穿梭质粒导入IL1403，借助IL1403染色体上相应lcn C和lcn D基因的互补作用，就可以合成有生物活性的lactococcin A。值得一提的是，lcn C和lcn D基因与G-菌中负责蛋白分泌的基因高度同源，lcn C编码一个716氨基酸的蛋白(lcn C，该蛋白属于ATP-结合蛋白家族，lcn C的C-端是一个200个氨基酸大小的ATP-结合结构域，N-端则有3个大的疏水片段。lcn D基因编码一个474氨基酸的蛋白，此蛋白与一些参与跨膜运输的内膜蛋白(如Hly D)有着高度的结构类似性。pediocin PA-1操纵子结构中最大的ORF编码一个724氨基酸的蛋白，对库同源检索表明该蛋白隶属于ATP-Hly B家族，其大小与前述lactococcin A的lcn C蛋白相似，且两者在ATP-结合区和跨膜片段区有明显相似性［5，6］　另外，在缺失lcn C和lcn D基因时，IL1403染色体上的分泌系统仍能正确指导lactococcin A、B和M的跨膜转运，提示lactococcin转运机制也可能适用于其它异源蛋白转运；三种细菌素前体分子N-端先导区的高度同源序列是跨膜转运过程的识别信号。类似的跨膜转运机制在lantibiotics中亦有所发现［9］，例如,nisin的nis T，subtilin的spa T基因所编码的蛋白都是Hly B蛋白家族成员。看来，对于能产生SHSP的G+菌，其体内可能存在一种相同的由信号肽介导的细菌素跨膜转运机制　2.4　作用机制　以lactococcin A和 lactococcin B的作用机制研究较为深入，van Belkum等人［7］系统研究了lactococcin A对乳球菌敏感株膜质体、抗性株膜质体以及完整细胞的作用机理，发现纯品lactococcin A能够增加敏感株的膜通透性，导致膜电势崩溃，使胞内和膜质体内的氨基酸、ATP等营养物质外流，但对脂质体无效。lactococcin B与lactococcin A的作用机制相似。两种细菌素均是在敏感菌细胞膜上形成亲水孔道，致使胞内营养物质外泄，胞外水分子流入，而达到抑制和杀死细胞的目的。与lantibiotics的作用机制不同，lactococcin在细胞膜上形成亲水性通透孔道是经膜上特定受体蛋白介导，与膜电位无关，因此又称这类细菌素为非能量依赖型细菌素［10］，其作用主要是破坏膜功能的稳定性(如能量转导。两种细菌素对脂质体无效进一步证实其抑菌作用依赖于膜上特定受体蛋白。携有lactococcin A和lactococcin B免疫基因的细胞能对这两种细菌素产生抗性，推测免疫蛋白可能就定位于细胞膜上。免疫蛋白与细胞膜表面特定受体蛋白的靶位点结合后，使该受体蛋白不能再介导细菌素在细菌细胞膜上形成亲水孔道，致使细菌对细菌素产生抗性。简言之，细菌素免疫蛋白的存在抑制了膜上亲水孔道的形成　3　大分子热不稳定蛋白细菌素(LHLP　这类细菌素都是产生于乳杆菌属，包括helveticin J、 lacticin A、lacticin B、acidophilucin A、和caseicin 80等［3］，其分子量较大(＞30kDa，对热敏感(90℃处理30min，失活。目前，对这类细菌素的研究不多，仅helveticin J 的研究较为深入。helveticin J是由lactobacillus helveticus 481产生的一个染色体编码的37kDa的细菌素，抑菌谱较窄，仅对一些同源乳杆菌有效；核酸序列分析表明细菌素编码区存在两个完整的开放读码框(ORF2和ORF3。ORF3是其结构基因(hly J，大小为999bp。ORF2紧邻于hly J上游，大小为315bp，编码一个11.8kDa的未知功能蛋白。此外，ORF2上游有一个启动子，hly J和DRF2前端有核糖体结合位点。hly J 尾端37bp处有一个ρ-终止子。ORF2的核糖体结合位点与启动子之间存在两段小的反向重复序列，可能在helveticin J的表达调控中起作用。helveticin J 的基因排列方式表明了它以操纵子形式表达，其邻近ORF的具体功能有待深入研究，目前倾向认为负责细菌素翻译后修饰加工、转运和免疫的基因应该与hly J紧密联锁［11］　4　羊毛硫抗生素(lantibiotics　lantibiotics的显著特点是分子内含有非编码氨基酸，包括羊毛硫氨酸、β-甲基羊毛硫氨酸、脱氢丙氨酸(DHa)和脱氢丁氨酸(DHb。非编码氨基酸的存在侧面提示了lantibiotics在形成过程中必定经过了翻译后的酶修饰与加工，这包括Ser和Thr脱水分别形成DHa和DHb； DHa和DHb与邻近Cys的巯基发生亲核加成反应，分别形成羊毛硫氨酸和β-甲基羊毛硫氨酸。根据lantibiotics的分子结构可将其细分为两类：一类是线型的，另一类是环型的。目前，研究最深、应用最广的是nisin，它与subtilin、epidermin、 gallidermin和pep5一样，都是线型分子，它们虽然来自不同的G+菌，但序列分析显示它们可能来自同一个祖先基因。多年来，nisin一直是乳酸菌所产lantibiotics的唯一代表，近年来，又从不同乳酸菌中分离出多种新的lantibiotics，包括粟酒乳杆菌产生的lactocin S，乳酸乳球菌产生的lacticin481，肉食杆菌产生的carnocin U149［3］。lactocin S是典型的环型lantibiotics(图2，分子中有2个羊毛硫氨酸，3个Dha和1个DHb，其分子结构与其它线型lantibiotics无明显相似性。lactocin S的结构及免疫基因定位在粟酒乳杆菌L45的一个50kb质粒上，负责lactocin S前体肽翻译后修饰及跨膜转运的基因也都位于同一质粒上，这一点与epidermin相似，但与nisin和subtilin明显不同，后两者的结构及免疫基因定位于染色体上。lacticin481由乳酸乳球菌CNRZ481产生，前体肽由51个氨基酸组成，其中N-端24个氨基酸为信号肽，其余27个氨基酸则构成细菌素结构部分 (图2。环型lantibiotics的分子结构与线型的相比，有显著的差异，提示环型分子的翻译后修饰过程与机制可能明显不同于线型分子。线型的nisin、subtilin和epidermin中的硫醚环，尤其是N-端的a、b环高度保守(图2，侧面提示它们可能源于同一祖先基因。图2　nisin是一种含34个氨基酸的小肽，分子量约为3500Da，分子内不含芳香氨基酸，但含有DHa、DHb、羊毛硫氨酸和β-甲基羊毛硫氨酸。nisin的结构基因(nis A)位于染色体的可接合转座子上，转座子大小为70kb，其中在10kb的片段上分布着nis A、B、T、C、Z、P和K基因［3］，构成一个长度约为8.5kb的多顺反操纵子，其中5′-端有一个核糖体结合位点，3′-端有一个终止密码子和不依赖于ρ因子的转录终止子；多顺反子mRNA含有RNA修饰、加工信息，加工后产生一个267kb的mRNA转录产物。nisin前体肽由57个氨基酸组成，其中N-端23个残基构成信号肽区；信号肽在细胞表面被信号肽酶水解去除后，释放出成熟的、有生物活性的nisin。关于nisin的作用机制，报道不一。最初认为nisin的抑菌作用象一个阳离子表面活性剂；后来发现nisin分子中的DHa和DHb可能与细胞中酶的巯基发生作用［3］。还有人认为nisin的作用机制主要是消耗细菌胞内的质子动力［12］。目前，普遍接受的一个观点是：nisin是一个疏水的带正电荷的小肽，其作用机制与其它lantibiotics相似，作用靶位点是细菌细胞膜。在一定膜电位存在的条件下，nisin与细菌细胞膜结合形成通透性孔道结构，使ATP、K+等小分子和离子通过孔道流失，造成细胞膜渗漏和去极化，膜内外能差消失［12］，因其作用需膜电位的存在，故又称为能量依赖性细菌素　基金项目：山东医科大学青年基金资助作者简介：朱文淼(1968-，男，讲师，硕士　朱文淼（山东医科大学基础医学院，山东济南　250012）　刘　稳（山东大学微生物系，山东济南　250100）

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