维生素c含量的测定

在测定维生素C的国标方法中,荧光法为测定食物中维生素C含量的第一标准方法,2,4－二硝基苯肼法作为第二法. 一,荧光法1.原理样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后,与邻苯二胺（OPDA）反应生成具有荧光的喹喔啉（quinoxaline）,其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比,以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量.脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应,以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰.本方法的最小检出限为0.022 g/ml.2.适用范围GB12392-90 本方法适用于蔬菜,水果及其制品中总抗坏血酸的测定3.仪器3.1.实验室常用设备.3.2.荧光分光光度计或具有350nm及430nm波长的荧光计.3.3.打碎机.4.试剂本实验用水均为蒸馏水,试剂不加说明均为分析纯试剂.（1）偏磷酸－乙酸液：称取15g偏磷酸,加入40ml冰乙酸及250ml水,搅拌,放置过夜使之逐渐溶解,加水至500ml.4℃冰箱可保存7～10天.（2）0.15 mol/L硫酸：取10ml硫酸,小心加入水中,再加水稀释至1200ml.（3）偏磷酸－乙酸－硫酸液：以0.15mol/L硫酸液为稀释液,其余同4.1.配制.（4）50％ 乙酸钠溶液：称取500g乙酸钠（CH3COONa·3H2O）,加水至1000ml.（5）硼酸-乙酸钠溶液：称取3g硼酸,溶于100ml乙酸钠溶液（4.4）中.临用前配制.（6） 邻苯二胺溶液：称取20mg邻苯二胺,于临用前用水稀释至100ml.（7） 0.04%百里酚蓝指示剂溶液：称取0.1g百里酚蓝,加0.02mol/L氢氧化钠溶液,在玻璃研钵中研磨至溶解,氢氧化钠的用量约为10.75ml,磨溶后用水稀释至250ml.变色范围：pH=1.2 红色pH=2.8 黄色pH＞4.0 兰色（8） 活性炭的活化：加200g炭粉于1L 1+9盐酸中,加热回流1~2h,过滤,用水洗至滤液中无铁离子为止,置于110~120℃烘箱中干燥,备用.（9）标准抗坏血酸标准溶液（1mg/ml）：准确称取50mg抗坏血酸,用溶液（4.1）溶于50ml容量瓶中,并稀释至刻度.抗坏血酸标准使用液（100μg/ml）: 取10ml抗坏血酸标准液,用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml.定容前试pH值,如其pH＞2.2时,则应用溶液（4.3）稀释.标准曲线的制备：取下述"标准"溶液（抗坏血酸含量10μg/ml）0.5,1.0,1.5和2.0ml标准系列,取双份分别置于10ml带盖试管中,再用水补充至2.0ml.5.操作步骤5.1 样品制备全部实验过程应避光.称取100g鲜样,加100g偏磷酸-乙酸溶液,倒入打碎机内打成匀浆,用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度.如呈红色,即可用偏磷酸-乙酸溶液稀释,若呈黄色或兰色,则用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释,使其pH为1.2.匀浆的取量需根据样品中抗坏血酸的含量而定.当样品液含量在40~100μg/ml之间,一般取20g匀浆,用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml,过滤,滤液备用.5.2 氧化处理：分别取样品滤液及标准使用液各100ml于带盖三角瓶中,加2g活性炭,用力振摇1min,过滤,弃去最初数毫升滤液,分别收集其余全部滤液,即样品氧化液和标准氧化液,待测定.5.3 各取5ml标准氧化液于2个50ml容量瓶中,分别标明"标准"及"标准空白".5.4 各取5ml样品氧化液于2个50ml容量瓶中,分别标明"样品"及"样品空白".5.5 于"标准空白"及"样品空白"溶液中各加5ml硼酸-乙酸钠溶液,混合摇动15min,用水稀释至50ml,在4℃冰箱中放置2h,取出备用.5.6 于"样品"及"标准"溶液中各加入5ml50%乙酸钠溶液,用水稀释至50ml,备用.5.7 荧光反应取"标准空白"溶液,"样品空白"溶液及（5.6）中"样品"溶液各2ml,分别置于10ml带盖试管中.在暗室中迅速向各管中加入5ml邻苯二胺,振摇混合,在室温下反应35min,用激发光波长338nm,发射光波长420nm测定荧光强度.标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标,对应的抗坏血酸含量为横坐标,绘制标准曲线或进行相关计算,其直线回归方程供计算时使用.6. 计算 X=（c×V/m）×F×(100/1000)式中：X-----样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量,mg/100g；

c------由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液浓度,μg/ml；m-----试样质量,g；F------样品溶液的稀释倍数；

V------荧光反应所用试样体积,ml.例： 测定每一制备溶液的荧光强度.用标准溶液每ml含2.5μg,5.0μg,7.5μg及10.0μg,各标准浓度管读数减去相应的标准空白读数的各平均值做标准曲线.由样品液读数减去样品液空白读数之值,从标准曲线上查得相应的抗坏血酸（μg/ml）,按取样量及稀释率计算样品中抗坏血酸的含量.如：取制备好的辣椒样品2.138g,稀释到100ml,氧化后分别取10ml滤液稀释到50ml样品读数为23.34,样品空白读数为3.188,样品读数减去样品空白读数为20.152,查荧光标准曲线相当标准抗坏血酸的2.23μg.2.23×100 50 100-----×-×-- = 52（mg/100g）2.138 10 10007. 注意事项7.1 大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶,因此,抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用偏磷酸-醋酸提取液将样品制成匀浆以保存维生素C.7.2 某些果胶含量高的样品不易过滤,可采用抽滤的方法,也可先离心,再取上清液过滤.7.3活性炭可将抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸,但它也有吸附抗坏血酸的作用,故活性炭用量应适当与准确,所以,应用天平称量.我们的实验结果证明,用2g活性炭能使测定样品中还原型抗坏血酸完全氧化为脱氢型,其吸附影响不明显.,二,2,4-二硝基苯肼法1.原理总抗坏血酸包括还原型,脱氢型和二酮古乐糖酸.样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸,再与2,4-二硝基苯肼作用生成红色脎,脎的含量与总抗坏血酸含量成正比,进行比色测定.2.适用范围GB12392-90 本方法适用于蔬菜,水果及其制品中总抗坏血酸的测定.3. 仪器3.1恒温箱：37±0.5℃3.2可见-紫外分光光度计3.3打碎机4.试剂本实验用水均为蒸馏水,试剂纯度均为分析纯.4.1 4.5mol/L硫酸：谨慎地加250ml硫酸（比重1.84）于700ml水中,冷却后用水稀释至1000ml.4.2 85%硫酸：谨慎地加900ml硫酸（比重1.84）于100ml水中.4.3 2%2,4-二硝基苯肼溶液：溶解2g 2,4-二硝基苯肼于100ml4.5mol/L硫酸内,过滤.不用时存于冰箱内,每次用前必须过滤.4.4 2%草酸溶液：溶解20g草酸于700ml水中,稀释至1000ml.4.5 1%草酸溶液：稀释500ml 2%草酸溶液到1000ml.4.6 1%硫脲溶液：溶解5g硫脲于500ml 1%草酸溶液中.4.7 2%硫脲溶液：溶解10g硫脲于500ml1%草酸溶液中.4.8 1mol/L盐酸：取100ml盐酸,加入水中,并稀释至1200ml.4.9 活性炭：将100g活性炭加到750ml 1mol/L盐酸中,回流1~2h,过滤,用水洗数次,至滤液中无铁离子（Fe3+）为止,然后置于110℃烘箱中烘干.4.10 标准（1）抗坏血酸标准溶液（1mg/ml）：溶解100mg纯抗坏血酸于100ml 1%草酸溶液中.（2）标准曲线绘制加1g活性炭于50ml标准溶液中,摇动1min,过滤.取10ml滤液放入500ml容量瓶中,加5.0g硫脲,用1%草酸溶液稀释至刻度.抗坏血酸浓度为20μg/ml.取5,10,20,25,40,50,60ml稀释液,分别放入7个100ml容量瓶中,用1%硫脲溶液稀释至刻度,使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1,2,4,5,8,10及12μg/ml.按样品测定步骤形成脎并比色.以吸光值为纵坐标,以抗坏血酸浓度（μg/ml）为横坐标绘制标准曲线.5. 操作步骤5.1样品制备全部实验过程应避光.5.1.1鲜样制备：称100g鲜样和100g2%草酸溶液,倒入打碎机中打成匀浆,取10-40g匀浆（含1-2mg抗坏血酸）倒入100ml容量瓶中,用1%草酸溶液稀释至刻度,混匀.5.1.2干样制备：称1-4g干样（含1-2mg抗坏血酸）放入乳钵内,加入1%草酸溶液磨成匀浆,倒入100ml容量瓶中,用1%草酸溶液稀释至刻度,混匀.5.1.3将上述两液过滤,滤液备用.不易过滤的样品可用离心机沉淀后,倾出上清液,过滤,备用.5.2氧化处理：取25ml上述滤液,加入0.5g活性炭,振摇1min,过滤,弃去最初数毫升滤液.取10ml此氧化提取液,加入10ml 2%硫脲溶液,混匀.5.3呈色反应5.3.1于三个试管中各加入4ml稀释液.一个试管作为空白,在其余试管中加入1.0ml 2%2,4-二硝基苯肼溶液,将所有试管放入37±0.5℃恒温箱或水浴中,保温3h.5.3.2 3h后取出,除空白管外,将所有试管放入冰水中.空白管取出后使其冷到室温,然后加入1.0ml 2%2,4-二硝基苯肼溶液,在室温中放置10~15min后放入冰水内.其余步骤同样品.5.3.3 85%硫酸处理：当试管放入冰水后,向每一试管中加入5ml85%硫酸,滴加时间至少需要1min,需边加边摇动试管.将试管自冰水中取出,在室温放置30min后比色.5.3.4 比色：用1cm比色杯,以空白液调零点,于500nm波长测吸光值.6. 计算同荧光法.7. 注意事项7.1 大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶,因此,抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用2%草酸溶液制成匀浆以保存维生素C.7.2 若溶液中含有糖,硫酸加得太快,溶解热会使溶液变黑.7.3 试管自冰水中取出后,颜色会继续变深,所以,加入硫酸后30分钟应准时比色.